一步法RT-qPCR Mix

NuHi eRT One Step RT-qPCR Probe Kit         货号:NH9234   规格:20反应
NuHi eRT One Step U+ RT-qPCR Probe Kit (抗污染版)货号:NH9248  规格:20反应

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产品介绍

该产品是一款以RNA为模板的探针法RT-qPCR试剂盒。可用于人源、病毒、细菌RNA或者体外转录RNA等的半定量/定性检测。

该试剂盒包含NuHi® eRT Mix 和NuHi® RT-qPCR Mix两个部分。

NuHi® eRT Mix部分的NuHi® eRT酶是通过对M-MLV Reverse Transcriptase突变改造获得的全新逆转录酶,具有较高的延伸性、反应效率,同时支持高温反应,对于GC含量高或者具有二级结构的RNA模板也具有较好的兼容性。

NuHi® eRT One Step U+ RT-qPCR Probe Kit中,以dUTP 100%取代dTTP,添加热敏UNG,与普通版本相比,在保证除污染的同时,扩增效果无任何降低。

 

产品特点

多重检测  支持4-5重探针检测。

抗污染体系  室温快速去除气溶胶污染,50℃ UNG酶迅速失活,保证扩增结果的特异性和准确性,且与非抗污染Kit(货号:NH9234)相比,抗污染Kit(货号:NH9248)的扩增效率没有降低。

检测灵敏度高  可检测个位数拷贝的模板。

可耐受高逆转录温度  55℃可以有显著的反转录扩增效果,利于更好的扩增高GC和二级结构复杂的RNA模板。

高稳定性  25℃加速26天功能仍正常,全组分混合MIX 冻融12次仍保持性能稳定。


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1. 常见的扩增曲线异常有哪些,如何解决?

 (1) 扩增曲线不光滑:信号太弱,经系统矫正后产生。建议提高模板浓度重复实验。

 (2) 个别扩增曲线突然骤降:反应管内留有气泡,由于温度升高后气泡破裂,使仪器检测到的荧光值突然降低所致。建议反应前要仔细检查反应管内是否有气泡残留。

 (3) 扩增曲线呈锯齿状且不连续:ROX添加不当。需校正参比染料。


2. 标准曲线扩增效率小于90%或者大于120%,线性关系不佳

 (1) 加样误差。加大模板稀释倍数,提高加样体积。加大稀释体积,使不同稀释梯度的浓度更准确。

 (2) 标准品降解。重新制备标准品,重复实验。

 (3) 模板浓度过高。存在反应抑制,增加模板稀释倍数。

 (4) 引物扩增特异性不好。重新设计引物,重复实验。


3. 阴性对照出现明显扩增

(1) 反应体系污染。更换新的Mix、水、引物重复实验。反应体系在超净工作台内配制,减少气溶胶污染。

(2) 扩增为引物二聚体引起。配合融解曲线进行分析。


4. CT值出现太晚

(1) 扩增效率极低。优化反应条件,尝试三步法扩增程序,或者重新设计合成引物。

(2) 模板浓度太低。减少稀释度重复实验,一般未知浓度的样品先从最高浓度做起。

(3) 模板降解。重新制备模板,重复实验。

(4) PCR产物太长。推荐PCR产物长度为80 bp-150 bp。

(5) 体系中存在PCR抑制剂。一般为模板带入,加大模板稀释倍数或者重新制备模板重复实验。


5. 反应结束无扩增曲线出现

 (1) 模板浓度太低。减少稀释度重复实验,一般未知浓度的样品先从高浓度做起。 

 (2) 模板降解。重新制备模板,重复实验。

 (3) 反应循环数不够。一般设置循环数为40,但需要注意的是过多的循环会增加过多的背景信号,降低数据可信度。

 (4) 确认程序中是否设置了信号采集步骤。两部法扩增程序一般将信号采集设置在退火延伸阶段;三步法扩增程序  应当将信号采集设置在72℃延伸阶段。

 (5) 确认引物是否降解。长时间未使用的引物应先通过PAGE电泳检测完整性,以排除引物降解的可能性。


6. 峰型扩增距离S型差异较大或融解曲线出现多峰

 (1) 引物设计不优。根据qPCR设计原则设计、合成新的引物。

 (2) 引物浓度太高。适当降低引物浓度。

 (3) cDNA模板带有基因组污染。重新制备cDNA模板。

 (4) 确认引物设计最好跨外显子,减少基因组污染带来的干扰。


7. 实验重复性差

 (1) 加样体积失准。使用准确度较好的移液枪,扩大反应体积,将模板做高倍稀释,以大体积加入反应体系中。

 (2) 定量PCR仪不同位置温度控制不一致。定期校准仪器。

 (3) 模板浓度太低。模板浓度越稀,重复性越差,减少模板稀释度或提高加样体积。

 (4) 做4-6个复孔,删除其中重复性不好的孔,将剩余的进行后续计算。


8. 如果内参CT值很低,目标基因CT值很高,该如何稀释样品?

可以在定量内参的时候将模板稀释,而定量目的基因时模板不稀释,但要保证不同样品在检测同一基因时稀释倍数要一致。


9. 如何预防气溶胶污染?

在加样的时候要谨慎操作,尽可能在超净工作台中进行加样,并注意通风。扩增反应结束后,请不要打开产物的管盖,不要跑胶。如果气溶胶污染情况很严重,建议采用通风结合含强氧化剂的消毒液进行处理。或者采用抗污染版本试剂进行实验,可大幅减少气溶胶带来的污染。


10. 怎么做绝对定量?

首先需要有一个已知拷贝数浓度的样品作为标准品,将其稀释至少5个梯度后和待测样品同时上机进行定量检测,以标准品拷贝数的Log值为横坐标,以标准品的CT值为纵坐标绘制标准曲线方程,将检测获得的待测样品的CT值带入标准曲线方程中就能求得待测样品的拷贝数浓度。


11. 模板的稀释液选择

稀释模板可以使用购买的Nuclease-free water、DEPC水或者实验室自备的ddH2O等。TE里如果EDTA超过0.1mM不建议使用TE稀释模板。